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ｉｐｓ細胞4
脚注 [編集]
文献 [編集]
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ヒトiPS細胞の樹立 [編集]マウスとヒトは遺伝子レベルで多くの類似性があるものの、マウスES細胞とヒトES細胞とでは、培養法や発現している遺伝子の種類などにおいていくつか異なる点がある。マウスiPS細胞の成功を受けて、同様の手法がヒトへも応用可能であるか大きな関心が集まった。
山中らは、マウスiPS細胞の樹立に用いた4遺伝子のヒト相同遺伝子であるOCT3/4・SOX2・KLF4・C-MYCを、ヒト由来線維芽細胞（36歳女性の顔面の皮膚由来の線維芽細胞、69歳男性由来の滑膜細胞、および新生児包皮由来の線維芽細胞）に導入してヒトiPS細胞の樹立に成功した[11]。また、世界で初めてヒトES細胞を樹立したことで知られるジェームズ・トムソン (James Thomson) らのグループも、山中らがマウスiPS細胞を初めて樹立した時と同じ戦略を用い、14個の候補遺伝子の中からOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の4遺伝子を選び出してヒトiPS細胞の樹立に別個に成功した[12]。両グループの研究成果は、2007年11月20日、山中らの報告がセル誌に、トムソンらの報告がサイエンス誌にそれぞれ同日発表された[注 7]。そのわずか後の12月には、ハーバード幹細胞研究所のジョージ・デイリー (George Daley) らのグループも、OCT3/4・SOX2・KLF4・C-MYCの4遺伝子にhTERT・SV40 large Tを加えた6遺伝子を用いてヒトiPS細胞の樹立に別個に成功しており、競争の激しさが窺える[13]。この報告では、山中らやトムソンらが市販されている培養細胞を用いたのとは異なり、成人男性の手掌の皮膚から採取した細胞をもとにiPS細胞を樹立しており、実際にヒトの個体からiPS細胞を樹立可能であることが示された。
特許権をめぐる競争 [編集]ヒトiPS細胞の樹立については、山中らよりもバイエル薬品が先行していた可能性が指摘された。山中らの実験を聞いた2006年8月に開発に着手し、2007年春には作製に成功していたという。これは山中らの論文発表（2007年11月）に先行する。一方、実際の特許出願時期は、バイエル社の2007年6月に対して京大グループは2006年12月であり、山中らの方が先んじていたことが判明している。しかしながら、特許記載内容からも、ヒトiPS細胞はこの時点で作製されておらず、2007年7月に作製されたことが公表されている。バイエル社の樹立法は山中らの樹立法と異なる点もあるので、バイエル社の特許は方法を限定して部分的に認められる可能性もある。同様のことは、米国の研究グループの方法についても当てはまる[注 8]。
iPS細胞の将来と課題 [編集]iPS細胞樹立の成功により、ES細胞の持つ生命倫理的問題を回避することができるようになり、免疫拒絶の無い再生医療の実現に向けて大きな一歩となった。 宗教界からの評価の一例として、ローマ法王庁の生命科学アカデミー所長のスグレッチャは「難病治療につながる技術を受精卵を破壊する過程を経ずに行えることになったことを賞賛する」との趣旨の発表を行った。[注 9][注 10]
2007年12月には、ヤニッシュらのグループにより、ヒトの鎌状赤血球症遺伝子を組み込んだモデルマウスの尾からiPS細胞を樹立した後、相同組換えにより原因遺伝子を野生型へと置き換え、造血幹細胞に分化させた後モデルマウスに移植するという、iPS細胞を利用した新たな遺伝子治療モデルが発表された[14]。
2009年3月には、ウイルスを使わないでiPS細胞を作成する方法が発表された。英エディンバラ大の梶圭介グループリーダーらによる。
しかし、真の実用化までには、まだ課題がある。
マウスの実験において表面化した最大の懸念は、iPS細胞の癌化であった。iPS細胞の分化能力を調べるためにiPS細胞をマウス胚盤胞へ導入した胚を偽妊娠マウスに着床させ、キメラマウスを作製した所、およそ20%の個体において癌の形成が認められた。これはES細胞を用いた同様の実験よりも有意に高い数値であった。この原因は、iPS細胞を樹立するのに発癌関連遺伝子であるc-Mycを使用している点と、遺伝子導入の際に使用しているレトロウイルスは染色体内のランダムな位置に遺伝子を導入するため、変異が起こり、内在性発癌遺伝子の活性化を引き起こしやすい点が考えられた。その後、山中教授らは発癌遺伝子を使用しないiPS細胞の作出に成功したが、作出効率が極めて低下（1/100といわれる）するとの問題があり、効率を改善する手法の開発が進められている。また、レトロウイルスを用いないでiPS細胞を作出する手法の開発も多くのグループにより進められている。
2010年に癌化によるリスクを回避できる方法として、遺伝子操作を行わずに薬品の投与のみで細胞をIPS細胞に変換する手法が考案された[15]。米ハーバード大学の森口尚史研究員らは肝臓がんの元となる細胞(肝がん幹細胞)に２種類の抗がん剤の新薬候補物質を加えたところ、２日後にはほぼ正常な肝細胞に変化することを発見した。この肝細胞に、山中教授が発見した遺伝子の働きを活性化させる別の抗がん剤４種類を４日間投与したところ、２週間後にIPS細胞ができた。がん細胞は染色体の数などに異常があるが、作られたIPS細胞は正常で、肝臓や腸管、筋肉などの細胞に変化させることができたという。この手法では、遺伝子もウイルスも使用しないため、IPS細胞の作成方法の安全性は向上するだろう。
また、マウスES細胞が樹立されてから17年[16]、ヒトES細胞が樹立されてから10年が経ち、定期的に脈打つ心筋細胞や軸索を持った神経細胞、インスリンを分泌する膵β細胞など、ES細胞からさまざまな種類の細胞を作り出すことに成功しているが、大部分はまだ細胞レベルの基礎研究であり、実際に移植した際の機能や組織補完能力についてはまだ良く分かっていない。また、高度な機能と構造を持った組織や臓器レベル(心臓、脳、膵臓等)の再生は、実用化に程遠いのが実状である。
一方、iPS細胞の基礎医学・創薬への応用は、近い将来実現すると考えられており、難病患者由来のiPS細胞樹立や薬剤評価の研究発表が今後相次ぐと考えられる。
21世紀はバイオの時代という言葉もある。今後の発展がきわめて期待されている。 |
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山中らのグループは、体細胞を多能性幹細胞へとリプログラムする因子を探索する過程で、ES細胞に特異的に発現するFbx15という遺伝子に着目し、Fbx15をネオマイシン耐性遺伝子に置換したノックアウトマウスを作製していた[1]。このマウスには明らかな異常は認められなかったが、山中らは『通常はFbx15を発現しない線維芽細胞が、何らかの方法で多能性を獲得するとFbx15を発現するようになる』との仮説を立て、ノックアウトマウス由来の線維芽細胞にレトロウイルスベクターを用いて候補遺伝子を導入した後、ES細胞の条件でG418[注 5]を添加して培養するという実験系を構築した（図）。彼らの仮説に基づけば、Fbx15を発現しない線維芽細胞はG418によって死滅するが、多能性を獲得した細胞はFbx15遺伝子座上のネオマイシン耐性遺伝子が発現し、G418耐性となって生き残ると考えられた。
ES細胞で特異的に発現し、分化万能性の維持に重要と考えられる因子を中心に、24個の候補遺伝子を選んで導入実験を行ったが、どの遺伝子も単独ではG418耐性を誘導できなかった。そこで24個すべての遺伝子を導入したところ、G418耐性の細胞からなるコロニーを複数形成することに成功した。この細胞を分離培養するとES細胞に酷似した形態を示し、長期に継代可能であった。彼らはこのES様細胞株を「iPS細胞」と命名し、24遺伝子の絞り込みを行い、最終的にiPS細胞を樹立するには4遺伝子で十分であることを突き止めた。この4遺伝子はOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycで、発見者の名を取り“山中因子 (Yamanaka factors)”とも呼ばれている。これらの研究成果は、2006年8月にセル誌に掲載された[2] [注 6]。
マウスiPS細胞作製法の改良 [編集]Fbx15遺伝子の発現によって選別され樹立されたiPS細胞は、細胞形態や増殖能、分化能などにおいてES細胞と極めて良く似ていたが、一部の遺伝子の発現パターンや、DNAメチル化パターンなどはES細胞と異なっていた。また、ヌードマウスの皮下に移植すると3胚葉成分からなる奇形腫をつくることができるが、胚盤胞に注入してもiPS細胞由来の細胞が混在したキメラマウスは産まれなかったことから、ES細胞と同様の分化万能性を持つとは言い難かった。山中らは、ES細胞の万能性維持に重要なNanog遺伝子の上流にGFPおよびピューロマイシン耐性遺伝子を挿入したトランスジェニックマウスを作製し、このマウス由来の線維芽細胞に上述の4遺伝子を導入して、Nanogの発現レベルによってiPS細胞を選別、樹立した。2007年7月に発表されたこの改良iPS細胞（Nanog-iPS細胞）は、オリジナルのiPS細胞（Fbx15-iPS細胞）に比べてよりES細胞に近い遺伝子発現パターンを示し、胚盤胞への注入により成体キメラマウスを得ることが可能で、さらにキメラマウスとの交配で次世代の子孫にiPS細胞に由来する個体が産まれること (germline transmission) が確認された[4]。時をほぼ同じくして、MITのルドルフ・ヤニッシュ (Rudolf Jaenisch) らのグループ[5]、ハーバード大学ハーバード幹細胞研究所のコンラッド・ホッケドリンガー (Konrad Hochedlinger) とUCLAのキャスリン・プラース (Kathrin Plath) らのグループ[6]からも、同様の研究成果が報告された。
遺伝子導入によって多能性を獲得した細胞を選別する際に、Fbx15やNanogなど特定の遺伝子の発現を指標とする場合、GFPや薬剤耐性遺伝子などのレポーター遺伝子を特定の遺伝子座に組み込んだトランスジェニックマウスやノックインマウスなどの遺伝子改変動物が必要となる。しかし、ヒトの場合はこれらの遺伝子改変技術は適用できないため、iPS細胞の樹立に際して大きな障害となっていた。2007年8月、ヤニッシュらのグループは、野生型マウス由来の線維芽細胞に4遺伝子を導入後、細胞の形態変化によってiPS細胞を選別、単離することに成功し、遺伝子改変マウスを用いなくてもiPS細胞が樹立できることを報告[7]、ヒトiPS細胞の樹立へと道を拓いた。同年9月には、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のミゲル・ハマーリョ−サントス (Miguel Ramalho-Santos) らのグループも、薬剤による選別を行わず、c-Mycの代わりにn-Mycを、またレトロウイルスベクターの一種であるレンチウイルスベクターを用いてiPS細胞を樹立した[8]。
また2007年12月には、c-Mycを除くOct3/4・Sox2・Klf4の3因子だけでも、効率は低下するがマウス・ヒトともにiPS細胞の樹立が可能であることが山中らによって示され、iPS細胞が癌化するのを抑えるのに成功した[9]。ほぼ同時にヤニッシュらのグループも同様の実験にマウスで成功している[10]。
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概略 [編集]
植物は基本的には組織切片から全体を再生することができる。例えばニンジンを5mm角程度に切り出し、エタノールなどにつけて消毒し、適切な培地に入れて適切な（温度・日照などの）条件におけば胚・不定芽などを経て生育し、元のニンジン同様の形になる（組織培養）。
しかし、（高等）動物では、受精卵以外の組織はこうした能力（全能性）を持たない。一方、培養下において、すべての組織に分化し得る能力（分化万能性）を持つ細胞は存在する。一般論をいえば、これらの分化万能性を持つ動物の細胞を適切な培地にいれて適切な条件で培養しても、秩序だった組織は形成されず、細胞の塊ができるだけである。しかし、これらの細胞から組織、器官を分化・形成させることができれば、事故や病気などで失ってしまった体の部分を移植元の人体の提供なしに移植することができる。また、他人の組織移植に伴う拒絶反応の発生を抑制することも可能となると考えられる。そのため培養による組織の形成には様々な試みがなされてきた。
ES細胞はその代表例であり、体を構成する様々な細胞に分化誘導できることが知られていた。しかしES細胞は発生初期の胚からしか得ることができず、胚の採取が母体に危険を及ぼすことや、個体まで生育しうる胚を実験用に滅失してしまうことについては倫理的な問題が指摘されている。
そのため、皮膚や血液など、比較的安全に採取でき、再生が可能な組織からの分化万能性をもった細胞の発見が期待されていた。
iPS細胞樹立の背景 [編集]ヒトの体はおよそ60兆個の細胞で構成されているが、元をたどればこれらの細胞はすべて、たった一つの受精卵が増殖と分化を繰り返して生まれたものである。この受精卵だけが持つ完全な分化能を全能性 (totipotency) と呼び、ヒトを構成するすべての細胞、および胎盤などの胚体外組織を自発的に作り得る能力を指す。受精卵が胚盤胞まで成長すると、胚体外組織を形成する細胞と、個体を形成する細胞へと最初の分化が起こる。後者の細胞は内部細胞塊に存在し、胚体外組織を除くすべての細胞へ分化できることから、これらの細胞がもつ分化能を分化万能性 (pluripotency) と呼ぶ。この内部細胞塊から単離培養されたES細胞もまた分化万能性を持ち、個体を構成するすべての細胞に分化できる。なお、成人にも神経幹細胞や造血幹細胞など、種々の幹細胞が知られているが、これらの幹細胞のもつ分化能は、神経系や造血系など一部の細胞種に限られているため、多能性 (multipotency) と呼ばれている。
ES細胞などの分化万能細胞は、培養条件によって分化万能性を維持したまま増殖したり、多種多様な細胞へ分化することができる。しかしながら、同一個体においては、分化万能細胞も体細胞も核内にもつ遺伝子の塩基配列は（テロメアなど一部を除き）全く同一であり、分化能の違いは、様々な遺伝子の発現量と、それを制御するクロマチン修飾、及びDNAメチル化などのエピジェネティックな情報の違いに由来すると考えられている。例えば、ES細胞はOct3/4やNanogなどの遺伝子を発現してES細胞としての分化万能性を維持しているが、終末分化した体細胞ではこれらの遺伝子は発現していない。全ての体細胞はOct3/4やNanogの遺伝子を核内に持ってはいるが、様々な転写因子やエピジェネティック機構により、発現が抑制されているのである。
こうした遺伝子発現パターンの違いを解析し、人為的に切り替えることができれば、分化した体細胞を未分化な分化万能細胞へと戻すこと（リプログラミング）ができると考えられていた。この仮説を裏付けていたのが、核移植技術によるクローン胚作製の成功である。すなわち、体細胞の核を取り出し、核を取り除いた未受精卵[注 4]内に移植することによって、核内の遺伝子発現パターンが未分化な細胞のパターンにリプログラムされることが示されている。また、体細胞をES細胞と融合させることにより、体細胞のもつゲノムがES細胞様に変化することも知られていた。これはつまり、卵やES細胞の中に、核内のエピジェネティックな情報をリプログラムすることが可能な因子が含まれていることを意味している。ただし、その因子が一体何であるのかは、長い間謎に包まれていた。
マウスiPS細胞の樹立 [編集]38巻、2007年12月。 |
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