初心者からのNGS解析 ~悪戦苦闘日記２~

素人でもできるNGS解析！というわけで続編です。(１年以上空いてるけど、しれっと書きます)

前回のところではFASTQファイルのプレプロセシングまでやりました。
今回はここからTopHatによるマッピングです。

私が利用しているのは「DDBJ read annotation pipeline (以下DDBJ pipeline)」で、ここには各種演算のツールがおいてあります。

なので、ページ左側のタブから「Step.1 Mapping」をぽちっとして、方法で「TopHat」を選びます。
その後、事前にプレプロセシングしたデータを選択して、あとはページを順番に進めていくだけです。

ここで大事なのが「リファレンスゲノム」のデータです。
DDBJ pipelineではすでに「主要生物のゲノムデータ」がサーバーにおいてあり、選択肢からポチッとするだけでTopHatを動かすことができます。
しかし、私が解析しているラットに関しては昨年までありませんでした。
(今はおいてありますが、アノテーションが１バージョン前のものです)

というわけで、データを用意する必要があります。
TopHatでリファレンスゲノムを選ぶページにくると、「Download or upload reference」という項目があるので、ここをポチります。
そして、「使いたいゲノムデータのGenBank ID」を入力してください。
するとゲノムデータがとれます。
私の場合はラットの最新のもの (Rnor_6.0) が使いたかったので、CM000072.5からCM000092.5 (chr1 ~ chrX) とCM002824.1 (chrY)、AY172581.1 (chrM) をダウンロードしました。
(NCBIのAssemblyのデータベースにまとめてあるので、そこを参照)
染色体5本分くらいはまとめてダウンロードできますが、エラーがでることがあるので一つずつやった方がよいでしょう。
ダウンロードした各染色体ゲノムのデータは[Create Data set]でひとまとめにして、わかりやすい名前をつけておきましょう。

あとはそのままTopHatを実行するだけです。
するとSAMファイルが生成されます。(SAMファイルは次のCufflinksで使います)
ちなみに、FASTQファイルが分割されている場合は、まとめてファイルを選んでMappingすることでひとつのSAMファイルにすることができます。
ファイルの大きさやサンプル数にもよりますが、数時間 ~ 1日もあれば全部終わるでしょう。


次は「Cufflinks」になるわけですが、まずはページの左側[step-2]の[Workflow]をポチってください。
するとGalaxy/P-GALAXYというページに飛びます。

今後の作業はここでやることになるので、先ほど生成されたSAMファイルをこちらに移します。
左側タブの[Workflow]の中に[Import samfile  from DDBJ Pipeline]というのがあるので、こちらをポチってください。
するとSAMファイルがGalaxyの方に移せます。

最後に、このSAMファイルを「sorting」します。
Cufflinksはアルゴリズムの都合上、sortingしたSAMファイルでないと扱えないようなので、忘れずにやりましょう。

やり方は簡単です。
同じく[Workflow]のタブの中に[Cufflinks preprocessing]というのがあるので、これを選んで先ほどimportしたSAMファイルを選んで実行してください。
すると、[Sorted SAM file] というのができあがるはずです。

ここまででSAMファイルの準備はおしまいです。

次回 (連続して投稿しますが) はいよいよCufflinksです。