初心者からのNGS解析 ~悪戦苦闘日記６~ ( 生物学 ) - 実験室より一言申し上げます

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初心者からのNGS解析 ~悪戦苦闘日記６~

さて、今回はTopHat ~ Cufflinks準備の部分での修正Ver.となります。

前回実際に解析を行ったのですが、少々トラブルがありました。
今回はそのトラブルシューティングと実際にやったことについてです。

まず何があったのかというと、
TopHatで染色体21本を選んだにも関わらず、５本しかデータが参照されなかった
ということです。

Cuffdiffまで実際にやってみて、結果を見ながらおかしな所を探し、一個ずつ遡ってデータを見ていったところ、最初のTopHatでやらかしていたという涙目な結果だったのです。

この解析では
１．DDBJ pipelineのTopHatでGenBank IDを入力し、各染色体のデータセットをインポート
２．全部インポートしたらまとめてひとつのデータセットとして保存
３．これをリファレンスに指定してTopHatを実行
としたわけです。

が、どうもインポートしたゲノムデータセットがちゃんとしていなくて、参照された５本以外がおかしくなっていたようです。
DDBJの担当者によると、染色体をまとめて指定するとこういうことが起きるそうです。
以前に一括インポートを試みたことがあって、ダメなことはわかっていたので今回は全部個別にインポートしたのですが、それでもこういうことがあるんですね。。。
現在はこの件を踏まえ、デフォルトのMajor genome setにラットの最新のアセンブル (Rn6.0) が標準で選択できるようにしてくれたので、以後はこれを用いると安全でしょう。

そして、染色体名の書き換えです。

こちらは悪戦苦闘日記３でも書きましたが、上記の方法でTopHatを行った際も必要です。
(作業行程はこっちを参照してください)

標準ゲノムセットでTopHatを実行し、生成されたsamファイルをみてみると、例えば１番染色体が
gi|6619202784|gb|CM000072.5|
となっています。

一方、UCSCからインポートしたRefFlatファイルはchr1と書かれています。

なので、まずはUSCSからインポートした各染色体のRefFlatファイルを[Concatenate]で結合し、ひとまとめにします。→ これをファイル１とします。
(ゲノム全体をまとめてとってきてもY染色体の分ははいっていないので、Y染色体を別途インポートし、concatenateで結合させましょう)

このファイルをPCにダウンロードし、excel等を用いて文字列 [chr1] を [gi|6619202784|gb|CM000072.5|] に置換していきましょう。

置換したらtxt形式で保存し、再度Galaxyにアップロードします。→ ファイル２
で、ファイル２にファイル１を[Paste]します。
すると、ファイル１のデータの横にファイル２のデータがつながったファイルができあがります。→ ファイル３
上記の一連の操作の際に余計なタブ区切り認識で9列目がおかしくなっているので、[Cut]を用いてファイル３の[C1-C8,C18]を選択すると、まともな形式のGTFファイルになっているはずです。

あとは前回の様にCufflinksを実行してください。