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Ⅱ．抗リン脂質抗体検査の手順
A．LA活性の検査
ISTHのLA診断改訂ガイドライン5)では、LA活性の判定にスクリーニング検査→クロスミキシングテスト→確認試験と３段階のステップを要求している。著者らが推奨する抗リン脂質抗体検査の手順を図１に示した。LA検査用の血漿サンプルは、二重遠心分離法（2000G・15分間遠心→血漿採取後2000G・10分間再度遠心分離）にて血小板の混入を極力避けるように採取する。血漿分離後ただちにLA検査を実施できない場合には、血漿を−70℃以下で凍結保存する必要があるが、血漿中に血小板が残存していると凍結融解操作の際に血小板由来のリン脂質が溶出してサンプル中のリン脂質濃度が過剰になり偽陰性を呈する危険性がある。LA検査の第一段階は、リン脂質依存性凝固時間の延長を確認するスクリーニング検査であり、測定法としては、第一選択が希釈ラッセル蛇毒試験（diluted Russell’s viper venom test: dRVVT）、第二選択に活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time: APTT）が推奨されている。第一選択のdRVVT試薬として、本邦ではLAテスト「グラディポア」、ヒーモスアイエルdRVVT、コアグピアLA、LA1 Screen/LA2 Confirmationなどが市販されている。これらのLA判定用試薬では、スクリーニング検査と確認試験が一気に実施できるのが利点である。日本抗リン脂質抗体標準化カンファレンス（APS-WS）および日本血栓止血学会学術標準化委員会（JSTH-SSC）・抗リン脂質抗体部会により、dRVVTのcut-off値としてnormalized S/C ratio（normalized S:screen 試薬患者秒数／screen試薬正常秒数，normalized C: confirm 試薬患者秒数／confirm試薬正常秒数）が1.2以上でdRVVT系LA陽性と判定する。一方、第二選択がAPTTである。APTTも測定試薬によりLAに対する感受性が異なるため、LA検出に高感度で特異性の高い検査試薬を選択することが重要となる。日本検査血液学会標準化委員会ではLA検出に適した試薬として、PTT-LA、トロンボチェックAPTT-SLA、ヒーモスIL APTT-SP、コアグピアAPTT-Nなどを推奨している。実際の臨床検査では凝固系ルーチン検査に導入されているAPTTでスクリーニングされる場合が圧倒的に多く、APTTで延長が認められない場合はLA陰性と判定しがちであるが、LA陰性の判定には、APTT 正常のみならず、dRVVTのnormalized S/C ratioが1.2未満であることを確認しなければならない。APTTスクリーニング検査で凝固時間の延長が確認された場合、その延長が個々の凝固因子活性の低下ではなくインヒビターによるものであることを証明するために、被検血漿と正常血漿を一定の割合で混和し凝固時間の変化をパターンで判定するクロスミキシングテストを実施する。クロスミキシングテストのパターンは使用するAPTT試薬のLA感受性に大きく左右されるため、必ずスクリーニング検査で推奨されたAPTT試薬を用いる。ISTHのLAガイドライン改訂版では、被検血漿と正常血漿を50：50で等量混和した1ポイントでの判定を許可しているが、しばしばLA陽性の判定に困惑する。現時点では、被検血漿と正常血漿を5ポイント（被検血漿：正常血漿＝[0：100]・[10：90]・[20：80]・[50：50]・[100：0]）で測定し、[0：100] と[100：0]を結ぶ直線より上に凸のパターンか下に凸パターンか判定することを推奨する。凝固因子活性低下や欠乏症では下に凸のパターンを示す。一方、大部分のLAはリン脂質に対する即時型インヒビターであり上に凸のパターンを呈する。しかし、LAの10〜20％の症例で遅延型のパターン（混合直後では上に凸のパターンを示さない）を呈するケースがあり判定に困惑する。著者らの考えは、クロスミキシングテストでは、１ポイントでも上に凸のポイントがあれば、すなわち完全なる下に凸のパターンでなければ、LAの存在を疑って次の確認試験に進むべきである。クロスミキシングテストでLAを含むインヒビターの存在が疑われたサンプルに関しては、被検血漿に過剰なリン脂質を添加する確認試験を実施し、延長していた凝固時間がある一定レベル短縮した場合、APTT系LA陽性と判定する。APTT系の確認試験として保険収載されているキットはRoche Diagnostics社のStaclot LAⓇである。
しかし、LA検査には様々な課題が残されている。患者および正常血漿サンプルの処理方法（血小板除去処理・自家製正常プール血漿の作成方法など）が標準化されておらず、良質な血漿が得られないとLA活性の判定が不正確になる可能性がある。また、ヘパリンやワルファリンなどの抗凝固療法を施行中の患者では測定結果が信頼できない。さらに、感染症や薬剤に起因する一過性のLAが少なからず存在する。従って、抗リン脂質抗体の正確な検査診断は、LA検査のみでは不十分で、ELISAと組み合わせて確定診断する必要がある。
B．ELISAによる抗リン脂質抗体の定量
APS国際分類基準4)では、ELISAで検出する抗リン脂質抗体としてIgGおよびIgMクラスのaCLとaβ2GPIを採用している。本邦で普及しているELISAキットは、MBL社の「MESACUPカルジオリピンテスト」とヤマサ社の「抗CL・β2GPⅠキット」である。MESACUPカルジオリピンテストは、国際単位1GPL（1μg/mlのaCL力価）を1U/mlと設定してあるのでAPS国際分類基準に照合しやすい。測定原理はカルジオリピン感作マイクロカップに反応用緩衝液で希釈した検体を添加することにより緩衝液中に含まれるウシ血清由来のβ2GPⅠをコファクターとしてaCLを定量する。しかし、測定原理上、β2GPⅠ依存性aCL（APSの臨床病態に特異性の高い抗体）以外にも固相化CLに直接結合するβ2GPⅠ非依存性aCL（膠原病や感染症患者に出現する抗体）も混在して検出され、両者の鑑別は難しい。一方、抗CL・β2GPⅠキットは、固相化カルジオリピンに精製ヒトβ2GPⅠを添加した系と添加しない系で同時にaCLを測定し、β2GPⅠ存在下でのaCLが非存在下でのaCLよりも明らかに抗体価が高く、かつ基準値以上の場合を陽性と判定するためβ2GPⅠ依存性aCLを鑑別でき、臨床的有用性が高いが国際的な抗体価の比較が難しい。また、固相化リン脂質を用いないELISAも考案され、現在のAPS国際分類基準に採用されている。γ線照射により酸化処理を施したELISAプレートにβ2GPⅠを結合させたものを抗原として抗リン脂質抗体を検出する。本測定法で検出されるaβ2GPⅠは、基本的にはβ2GPⅠ分子上のエピトープを認識して結合する抗体を特異的に測定しており、APSの臨床病態により関連性が強いことが示されている。さらに近年、細胞膜の主要な酸性リン脂質であるホスファチジルセリンとプロトロンビンとの複合体に対する抗リン脂質抗体：抗ホスファチジルセリン/プロトロンビン抗体（aPS/PT）の測定系が確立されている。これまでの臨床研究から、aPS/PTはLA活性を示す主要な抗リン脂質抗体であり、APSの臨床病態に特異性が高いことが示されている7,8)。現時点では、APS国際分類基準に採用されていないが、将来的に有望視される抗リン脂質体である。
現在、aCL，aCL/β2GPⅠ，aβ2GPⅠ，aPS/PTを測定するためのELISAキットが複数社より販売されている。しかし、各社キットで測定される抗体価は、同一の抗体を定量するキットであってもキャリブレーターや単位が統一されていないため、同じ患者でも測定するキットにより測定値が異なる。さらに、各種キットで明確な基準値が設定されておらず、測定値の評価が難しい。そこで、APS-WSでは、本邦で市販されている10キットについて、多施設共同による共有基準範囲（絶対的健常人400名の99パーセンタイル未満）を設定した（表2）9)。既存のキットにおける抗体価の単位やキット間の測定値を統一することは困難であるが、試薬メーカーの枠を超えて共有基準範囲を一括して定めることにより、どのキットを用いて抗体価を測定しても、同一抗体のキットであれは、ほぼ同じ判定結果（陰性／陽性）が得られることを確認した。APS-WSでは、ELISAによるスクリーニング検査として第一選択は抗カルジオリピン抗体IgGで、市販キットとしては、MESACUP カルジオリピンIgG キットを推奨している。これは、臨床検査における抗リン脂質抗体の見逃しを是正する目的で、β2GPⅠ依存性および非依存性aCLを幅広く検出するためである。IgM-aCLの測定に関しては、IgG-aCLが陰性の場合に追試として実施するべきと考える。一方、aβ2GPⅠおよびaPS/PTの測定意義はAPSの検査診断を向上させる目的であり、さらに患者の血栓症発症リスクを層別化する一歩としても重要と考える。
近年、aβ2GPⅠのサブセットの中でも、β2GPⅠのドメインⅠに対する抗体：aβ2GPI-domainⅠが血栓形成作用を有することが確認され、研究段階ではあるが測定系が開発されている。著者らを含む幾つかの臨床研究10-12)により、aβ2GPI-domainⅠが動・静脈血栓症の発症に強く関連していることが示されており、今後、APS患者の血栓症発症リスク層別化に重要な項目となる。
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