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こんばんは。
今日は先日書いていた、シークエンスが途中で読めなくなる原因が突き止められたのでその報告と、大晦日にやらかした大失敗の実験についてです。
まずは悲報から。
実験を少しでも進めようと、12/30,31を利用してSDS-PAGEからのwestern blotを行っていたんですが、これが最後の最後で大失敗して、年末の努力が無に帰しました。
というのも、membraneに抗体処理をするとき、毎回抗体量が少なくて済むようにmembraneの目的のタンパクがあるであろう部分だけ切り取って抗体処理をしているのですが、今回5%ポリアクリルアミドゲルを初めて使ったこともあり（いつもは１０％）、マーカーを読み間違え、目的のタンパクがあるべきと事は全く異なる場所を切り取って抗体にあてていたのです＞＜
なのでもちろんフィルムに現像しようとしても、何も写らない。。。
ああ、年末わざわざ来て実験していたのは何の意味があったのだろうか、、、
ということでした。
まあ、次からは二度としないでしょうから良しとしましょう。
そしてシークエンスの原因究明の方ですが、あの記事を書いてから少し気になりeurofinのサイトにシークエンスのトラブルシューティングのPDFがあったので、それを読ませていただいてたところ、シークエンスが途中で止まる原因としてテンプレートの濃度が濃いというものがありました。
確かに今回のサンプルはかなり濃い目に取れていて、ああ、これが原因かもしれないと感じました。
さらに、うちのラボの同期が、EtOH沈をやるとうまく読めるときがあるという風に言っていたので、さあどっちが原因かと思い、この二つの要因について検証することにしました。
実験系としては、今回は前回と同様、SeqPCRしてからSeqにかけるまでに1日おき、前回と同条件の基行うことにしました。一つのサンプルでは、EtOH沈をしてそのまま基と同じ量のTEに溶かしたもの、もう片方はEtOH沈はせずにSeqPCRのときに使うサンプル量を半分にしたものです。
この条件でSequenceにかけたところ、なんとどちらも1000bpくらいまでばっちり読めるようになりました！！
EtOH沈は不純物を取り除く意図と考えられますが、EtOH沈をせずにテンプレートを半量にしただけのサンプルでもきれいに読めていることから、原因は不純物がPCRを阻害しているのではなく、テンプレートが多すぎていたということが結論づけられます。
ではなぜEtOH沈のほうでもSeｑがうまくいったんだといわれるかもしれませんが、私はEtOH沈はをしたことによって、同量のTEに溶かしたとしても精製する過程である程度のDNAが流出し、濃度が低下していたからだと考えます。
以上より、前回原因として考えていたSeqPCR後に長時間置くことはSequenceが途中で止まる原因ではなく、テンプレートが濃すぎたことが原因であると分かりました。
これは今後も十分あり得ることですから、電気泳動時のDNAの濃さなどを考慮し、濃かった場合は半量でSeqPCRにかけておく、等の解決策をとるのが良いと考えます。
結構文に起こすのは時間がかかりますね、適当に書いているので、文章や論理性の説明不十分なところがありますがお許しください。
あ、EtOH沈しないとうまくSeqができないといっていた同期ももしかするとおなじ要因で起きているかもしれないので、伝えておこうと思います。EtOH沈するのと半量だけ加えればいいのでは作業量にかなりの差がありますからね(;^^)
テンプレートが濃いとSeqPCRがうまくいかない理論的な説明については考えがありますのでもし暇な時間があればまたこのブログにさらっと書いておきたいと思います。
ではまた〜〜〜
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今日はシークエンスとwestern blotでしたが、ここ数日なぜかシークエンスで躓いています。
いまコンストラクションしている遺伝子が1.4kbpくらいなんですが、ベクターの両端からシークエンスにかけると前後300〜400ｂｐくらいしか読めてないんです。ひどいときは200bpくらい。。。
早急に原因を突き止めないと、いつまでたっても先に進めません。
今はおそらくSequence PCRしてからシークエンスするまで時間をおいてしまっていることが原因なのではないかと疑っています。
なので明日、明後日中にもう一度、seqPCRしたらすぐにEtOH沈してシークエンスにかける、という感じでやってみようと思います。これで治れば、今後気を付けることで同じミスをしないで済みますね。
今日は諦めます。。。
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お久しぶりです。
何というか本当にお久しぶりすぎてたぶんこの記事を見てくださる方はほとんどいないと思うのですが、日記を付けたいなと思いこの古いブログを再開しようかなと考えた所存であります。
昔の記事を見返すと本当に気持ち悪いですが、今もそんなに変わらないかもしれませんね。
今更ブログというのも時代遅れのような感覚ですが、何より文字数を打てるのはtwitterなどのSNSと比べて大きな利点ですよね。
ということで、日々の暮らしで思ったことや、実験してて考えた良いアイディアなんかをひっそりと書き記していくツールとしてブログを復活させようかなと思います。
ただの自己満ですが、見てくださりコメントなどしていただけると嬉しいです。
ではいまから実験しなくてはならないのでこのくらいで。
よいお年を。
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今日はバレンタインでしたね〜
あーあー今年も母親からと後輩がノリでくれたチョコだけでした〜(´▽｀；)ゞ し、仕方ないよね！男子校だもん() 小学校の時は結構貰ったし。。 ↑過去の栄光を語るクズ まぁ大学行ったらもらえるでしょ(震え声) ところで親のチョコがいつもおもろい 今回は、なんと“化石チョコ”!! ワケわかんないけど、なんかインコもついてきたw |
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今日でお手伝い最終日でした！
そんなに辛くなかったわりにはそれなりのお給料でした！ お金の価値が体感できた、いい経験になったと思います(*´-`) 手伝い終わったあとは、家に帰って『ダークナイト』を見てしまった(^^; やることいっぱいあるのにね。。 やることあるってわかっていても、ついついだらだらしてしまう自分... 今もコイツ↓と戯れてますw そして何よりｶﾜｲｲ・・・ 一人で寂しくぬいぐるみと戯れるオカヤドでしたー。。 |
